Isolating DNA
The first step in making recombinant DNA is to isolate donor and vector DNA. The bulk of DNA extracted from the donor will be nuclear genomic DNA in eukaryotes or the main genomic DNA in prokaryotes. Bacterial plasmids are commonly used vectors, and these plasmids must be purified away from the bacterial genomic DNA.
재조합 DNA를 만드는 첫 번째 단계는 기증자와 벡터 DNA를 분리하는 것이다. 추출 된 대량의 DNA는 진핵 생물의 핵 게놈 DNA 또는 원핵 생물의 주요 게놈 DNA이다. 세균성 플라스미드는 일반적으로 사용되는 벡터이며,이 플라스미드는 세균 게놈 DNA로부터 정제해야한다.
Cutting DNA
Restriction enzymes are produced by bacteria as a defense mechanism against phages. The enzymes act like scissors, cutting up the DNA of the phage and thereby inactivating it. Importantly, restriction enzymes do not cut randomly; rather, they cut at specific DNA target sequences, which is one of the key features that make them suitable for DNA manipulation. Any DNA molecule, from viral to human, contains restriction-enzymetarget sites purely by chance and therefore may be cut into defined fragments of a size suitable for cloning.
제한 효소는 파지에 대한 방어 기작으로서 박테리아에 의해 생산된다. 효소는 가위처럼 작용하여 파지의 DNA를 절단하여 불 활성화시킨다. 중요한 것은 제한 효소가 무작위로 절단되지 않는다는 것이다. 오히려 DNA 조작에 적합한 핵심 기능 중 하나 인 특정 DNA 표적 서열을 절단 한다. 바이러스에서 인간으로의 모든 DNA 분자는 우연히 제한 효소 목표 부위를 포함하므로 복제에 적합한 크기의 한정된 조각으로 잘라낼 수 있다.
For example, the restriction enzyme EcoRI cuts a circular DNA molecule bearing one target sequence, resulting in a linear molecule with single-stranded sticky ends.
예를 들어, 제한 효소 EcoRI는 하나의 표적 서열을 갖는 원형 DNA 분자를 절단하여 단일 가닥의 stichy 말단을 가진 선형 분자를 만든다.
Joining DNA
Both donor DNA and vector DNA are digested with the use of a restriction enzyme that produces sticky ends and then mixed in a test tube to allow the sticky ends of vector and donor DNA to bind to each other and form recombinant molecules.
DNA 및 벡터 DNA 모두 sticky 말단을 생성하는 제한 효소를 사용하여 분해 된 다음, 시험관내에서 벡터 및 삽입될 DNA의 sticky 말단이 서로 결합하여 재조합 분자를 형성하게 된다.
DNA fragments from the two sources can unite, because double helices form between their sticky ends. There are many opened-up vector molecules in the solution, and many different EcoRI fragments of donor DNA. Therefore a diverse array of vectors carrying different donor inserts will be produced.
두 가지 근원의 DNA 단편은 결합 할 수 있습니다. 왜냐하면 이중 나선이 끈적 끈적한 말단 사이에서 형성되기 때문입니다. 용액에는 많은 개방 된 벡터 분자가 있고 기증자 DNA의 많은 다른 EcoRI 단편이 있습니다. 따라서 다른 DNA가 삽입된 다양한 벡터들 생성된다.
Although sticky ends have united, the sugar-phosphate backbones are still not complete at two positions at each junction. However, the backbones can be sealed by the addition of the enzyme DNA ligase. Certain ligases are even capable of joining DNA fragments with blunt-cut ends.
sticky 말단의 당-인산 백본이 결합되어 있지만 여전히 완전하지 못하다. 그래서 DNA 리가 제를 첨가함으로써 완전 결합될수 있다. 특정 리가제는 blunt-cut DNA 단편을 연결할 수 있다.
Amplifying recombinant DNA
The ligated recombinant DNA enters a bacterial cell by transformation. After it is in the host cell, the plasmid vectoris able to replicate because plasmids normally have a replication origin.
재조합 DNA는 형질 전환에 의해 박테리아 세포로 들어간다. 플라스미드가 숙주 세포 내에 있는 경우, 플라스미드 벡터는 복제를 시작할 수 있기 때문에 플라스미드 벡터는 복제 할 수있다.
However, now that the donor DNA insert is part of the vector’s length, the donor DNA is automatically replicated along with the vector. Each recombinant plasmid that enters a cell will form multiple copies of itself in that cell.
그러나 기증자 DNA 삽입물이 벡터 길이의 일부가 되었으므로 삽입된 DNA는 벡터와 함께 복제된다. 세포에 들어가는 각각의 재조합 플라스미드는 그 세포에서 그 자체의 다중 복제물을 형성 할 것이다. .
The resulting colony of bacteria will contain billions of copies of the single donor DNA insert. This set of amplified copies of the single donor DNA fragment is the DNA clone
결과로 생긴 박테리아의 콜로니는 수십억개의 단일 DNA 삽입물을 포함하게 된다. 단일 DNA 단편이 삽입되어 증폭된 것이 DNA 클론이다.
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